Título
Identificación y caracterización de las cargas intracelulares asociadas a la miosina de clase V en el hongo filamentoso Neurospora crassa
Identification and characterization of intracellular cargoes associated to class V myosin in the filamentous fungi Neurospora crassa
Autor
ARIANNE RAMIREZ DEL VILLAR
Colaborador
Rosa Reyna Mouriño Pérez (Asesor de tesis)
Nivel de Acceso
Acceso Abierto
Materias
Resumen o descripción
El crecimiento apical polarizado es una característica fundamental de los hongos filamentosos, donde el movimiento de vesículas secretoras se realiza con ayuda de proteínas motoras a través del citoesqueleto de actina y microtubular. Específicamente, las miosinas de clase V son motores moleculares asociados a actina encargadas del transporte de cargas intracelulares en diferentes organismos. La asociación con la carga es mediada por la unión a adaptadores específicos. En Neurospora crassa existe solo una miosina de clase V (MYO-5) pero aún no queda claro las cargas que transporta, su dinámica y posible función en la morfogénesis de las hifas. Para identificar los adaptadores asociados con MYO-5, se hizo un ensayo de CoIP con anticuerpos anti-GFP utilizando la cepa MYO-5-GFP. Las proteínas aisladas fueron identificadas por espectrometría de masas y los adaptadores fueron seleccionados por análisis bioinformático, modelaje estructural y acoplamiento molecular. Las proteínas SNA-10 y RBA-1 fueron seleccionadas y se analizaron in silico para corroborar su asociación con MYO-5. Encontramos que la unión con estos adaptadores producía una gran estabilidad estructural en el dominio globular de la cola (GTD) de MYO-5, sugiriendo que SNA-10 y RBA-1 podrían estar asociados a MYO-5. El marcaje de los adaptadores con GFP para corroborar su asociación in vivo, afectó el desarrollo normal de las hifas. Para determinar la importancia del GTD de MYO-5 en la morfología de las hifas, generamos una versión truncada del GTD completo y una versión donde eliminamos el subdominio II en el GTD, y se analizó la localización de MYO-5. A diferencia de lo reportado, la morfología fue normal y la localización distinta en las hifas. Esto podría deberse a que el casete con el que se transformó pudo integrarse en otro sitio. Para conocer el comportamiento dinámico de MYO-5 con mayor detalle, analizamos las partículas individuales por TIRFM. Las partículas de MYO-5-GFP eran de distintos tamaños y la mayor parte del tiempo no se movían. Cuando se movían mantenían una velocidad de 1.08 µm s-1, aunque podían alcanzar velocidades de hasta 2.7 µm s-1 y el movimiento podía ser anterógrado o retrogrado. La velocidad de desplazamiento de MYO-5 sugiere que se trata de un motor no procesivo, que podría requerir de más de MYO-5 para transportar las cargas. Debido al efecto, previamente reportado, que la ausencia del gen completo myo-5 producía en la morfología de las hifas, observamos ...
Polarized apical growth is a fundamental characteristic of filamentous fungi. It implies the movement of secretory vesicles, which occurs with the help of motor proteins through the actin and microtubule cytoskeleton. Specifically, class V myosins are molecular motors associated with actin responsible for transporting intracellular cargoes in different organisms. Association with the cargo is mediated by binding to specific adapters. In Neurospora crassa there is only one class V myosin (MYO-5) but it is still unclear the cargoes it transports, as well as its dynamics and function in the morphogenesis of the hyphae. To identify the adapters associated with MYO-5, a CoIP assay with anti-GFP antibodies using strain MYO-5-GFP we were performed. The isolated proteins were identified by mass spectrometry and the adapters were selected by bioinformatic analysis, structural modeling and molecular docking. The proteins SNA-10 and RBA-1 were selected and analyzed in silico to corroborate their association with MYO-5. We found that the binding with these adapters produced a great structural stability in the globular tail domain (GTD) in MYO-5, suggesting that SNA-10 and RBA-1 could be associated with MYO-5. The labeling with GFP of these adapters to corroborate their association in vivo, affected the normal development of the hyphae. To determine the importance of the GTD in MYO-5 in the hyphal morphology, we generated a truncated version of the complete GTD and a version where the subdomain II of the GTD was eliminated, and analyzed the location of MYO-5. Unlike what has been previously reported, the morphology in the mutants was normal and the MYO-5 location different in the hyphae. This could be due to the fact that the cassette with which it was transformed could have been integrated in another site. To know the dynamic behavior of MYO-5 in better detail, we analyzed the individual particles by TIRFM. The MYO-5-GFP particles were of different sizes and most of the time they did not move. When they moved, maintained a speed of 1.08 µm s-1, although they could reach speeds of up to 2.7 µm s-1 and the movement could be anterograde or retrograde. The travel speed of MYO-5 suggests that it is a non-processive motor, which could require more than one MYO-5 to transport the cargoes. Due to the effect of absence of the complete myo-5 gene, previously reported, produced in the morphology of the hyphae, we observed the location and dynamics of the actin cytoskeleton ...
Editor
CICESE
Fecha de publicación
2019
Tipo de publicación
Tesis de doctorado
Recurso de información
Formato
application/pdf
Idioma
Español
Sugerencia de citación
Ramírez del Villar, A. 2019. Identificación y caracterización de las cargas intracelulares asociadas a la miosina de clase V en el hongo filamentoso Neurospora crassa. Tesis de Doctorado en Ciencias. Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada, Baja California. 96 pp.
Repositorio Orígen
Repositorio Institucional CICESE
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