Author: Marco Antonio Hernández Martínez

Actividad antifúngica desnakina de aguacate nativo mexicano (Persea americana var. drymifolia) producida en el sistema heterólogo Escherichia coli-pMAL

Marco Antonio Hernández Martínez (2016)

Instituto de Investigaciones Químico Biológicas. Maestría en Ciencias en Biología Experimental

Protein heterologous expression is a technique used to produce large quantities of proteins that are of particular interest to medical, industrial and agricultural research. Consists in the protein synthesis by a foreign organism. The most widely used host organisms are yeasts, mammalian cells and bacteria, due to low costs and levels of protein production, bacterial systems are the most used. In this work we reported the production of avocado snaking PaSn functionally active by heterologous expression in Escherichia coli strain ER2523. The peptide fused to the Maltose binding protein (MBP) resulted was not toxic for the strain. The MBP inhibits the biological function of snaking PaSn it favors the solubility of the peptide avoiding the formation of inclusion bodies and presents affinity to amylose used in the first step of purification by affinity chromatography. It was obtained an optimum performance with purification system established achieving 30% of the fusion protein MBP-snaking PaSn. Optimal performance with established purification system was obtained, achieving 30% of the fusion protein MBP-snaking PaSn. To release the peptide snaking PaSn of the fusion protein was use protease Factor Xa. The digestion with protease generated a peptide with size of 8 kDa similar to what was expected. In vitro tests showed that the purified peptide showed antifungal activity against Colletotrichum gloeosporioides and Botrytis cinerea phytopathogens of agronomical importance at concentrations of 150 μg/mL.

La expresión heteróloga es una técnica utilizada para producir grandes cantidades de proteínas que son de especial interés a nivel médico, industrial y agronómico. Consiste en la síntesis de una proteína en un organismo distinto al nativo. Los organismos hospederos más utilizados son levaduras, células de mamífero y bacterias, siendo estos últimos los más utilizados debido a su bajo costo de producción. En el presente trabajo se demostró la producción de un péptido antimicrobiano vegetal, snakina PaSn de aguacate “nativo mexicano” (Persea americana var. drymifolia), funcionalmente activo, por expresión heteróloga en Escherichia coli cepa ER2523. El péptido fusionado a la Proteína de unión a maltosa (MBP por sus siglas en inglés) no resultó ser tóxico para la cepa. La MBP inhibe la función biológica de snakina PaSn, favorece la solubilidad del péptido evitando la formación de cuerpos de inclusión y presenta afinidad a amilosa utilizada en el primer paso de purificación por cromatografía de afinidad. Se obtuvo un óptimo rendimiento con el sistema de purificación establecido, consiguiendo un 30% de la proteína de fusión MBP-snakina PaSn. Para liberar al péptido snakina PaSn de la proteína de fusión, se utilizó la proteasa Factor Xa. La digestión con la proteasa generó un péptido con un tamaño de 8 KDa similar al esperado. En los ensayos in vitro, se demostró que el péptido presentó actividad contra Colletotrichum gloeosporioides y Botrytis cinérea, fitopatógenos de importancia agronómica, a una concentración de 150 μg/mL de snakina PaSn.

Master thesis

CIENCIAS AGROPECUARIAS Y BIOTECNOLOGÍA IIQB-M-2016-1387 Expresión heteróloga Péptido antimicrobiano Proteína de unión a maltosa