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Análisis del efecto de toxinas de Anthopleura elegantisima, Conus californicus y Auronoctonus phaiodactylus en Mycobacterium tuberculosis

Analysis of the effect of whole venom and toxins fractions from Anthopleura elegantisima, Conus californicus and Auronoctonus phaiodactylus against Mycobacerium tuberculosis

DANIELA ALEJANDRA MUNRO ROJAS (2005)

El incremento de Tuberculosis en personas inmuno deprimidas y el surgimiento de cepas multidrogo-resistentes en todo el mundo, ha originado la búsqueda de nuevos medicamentos contra Mycobacterium tuberculosis. El tratamiento contra Tuberculosis consiste de una terapia administrada por largos periodos, los cuales en su mayoría son agresivos y como consecuencia provocan efectos secundarios. Al menos el 2 % de la tuberculosis es causada por cepas de Mycobacterium tuberculosis multidrogo-resistente (MDR-TB) cuya tasa de recuperación o cura de los pacientes es menos del 60%. En los últimos años, la búsqueda de péptidos y toxinas a partir de organismos o productos de origen natural para combatir este problema es uno de los objetivos para el descubrimiento de nuevos fármacos que ataquen microorganismos resistentes a antibióticos. En este campo, ciertos grupos taxonómicos han desarrollado estrategias de origen químico para interactuar con otros organismos en su ambiente ya sea como defensa o para depredación. Los agentes usados por estos organismos constituyen una gran variedad de moléculas con características bioquímicas diferentes especializadas para cada grupo, muchas de ellas son de origen peptídico dirigidos receptores y canales iónicos. En esta investigación, se realizó el análisis del extracto crudo y fracciones obtenidas del veneno de Auronoctonus phaiodactylus (Alacrán), Anthopleura elegantisima (Anémona) y Conus californicus (Conus) en la cepa H37Rv de Mycobacterium tuberculosis. Las concentraciones mínimas inhibitorias (MCIs) fueron determinadas por los métodos colorimétricos MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)- difenil bromide of tetrazolium] y Azul Alamar (AA). Se encontró actividad antifímica del extracto crudo anémona, con una CMI (concentración mínima inhibitoria) de 40 mg/ml, del extracto crudo de Conus a 20 mg/ml y 7.5 mg/ml, dependiendo del método empleado; con la fracción I de anémona por cromatografía de exclusión molecular (SEC), y la fracción II de conus por HPLC ambas con una CMI de 400 µg/ml. También fue posible detectar actividad en la fracción por HPLC (cromatografía líquida de alta presion) de 15 a 20 minutos a partir de la Fracción I de anémona por SEC, a una CMI de 1.45 µg/ml. Para el caso del veneno de alacrán no se detectó actividad antifímica. Además, se realizó un análisis por PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) y por RFLPs (Polimorfismo en la Longitud de Fragmentos de Restricción), para la identificación de especies y un...

The increasing incidence of tuberculosis in immuno-compromised persons and the emergence of multidrug-resistant strain over world have highlighted the importance of screening effective novel drugs against Mycobacterium tuberculosis. The treatment of TB requires a multidrug regimen administrated over a long period of time, and a high level of compliance with therapy. At least 2% of tuberculosis is caused by multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB) and the cure rate of MDR-TB is reduced to less than 60. The screening of peptides and toxins from organism or natural products to struggle this problem in the last years is a great hit to discover novel drugs against microorganism resistant. In this field certain taxonomic groups have developed special chemical strategies for the interaction with other organisms in their environment. Conus californicus, Auronoctonus phaiodactylus and Anthopleura elegantisima are predators, they produce venoms with a remarkable diversity of pharmacologically active peptides, their targets are ion channels and receptors, and some others components having activity and specify. In this study, the activities of crude venom and fractions isolates from the venom apparatus of Conus californicus (Conus), the venom of Auronoctonus phaiodactylus (scorpion) and the extraction with ethanol 30% of Anthopleura elegantisima (Anemone) were investigated against strain H37RV of Mycobacterium tuberculosis. Minimum inhibitory concentrations (MCIs) were determined by colorimetric method MTT (3-(4,5)- dimetiltiazol-2-il)- difenil bromide of tetrazolium) and Blue Alamar. It was found activities from the crude extract of anemone with MIC (Minimum Inhibitory Concentration) of 40 mg/ml, the crude extract of conus with 20 mg/ml and 7.5 mg/ml depending the method employed, and with the fraction I of anemone by SEC (Size Exclusion Chromatography) and the fraction II of conus by HPLC with a MIC of 400 µg/ml. We also found an activity in the fraction from 15 to 20 minutes obtained by HPLC (High pressure liquid chromatography) from the fraction I by SEC with a MIC 1.45 µg/ml, but we did not find any activity with the venom of the scorpion. Besides it was carried an analysis by PCR (Polymerase Chain Reaction) and RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphism) of 96 clinical isolates for identification of species and epidemiologic date base of the Hospital General of Tijuana B.C. México.

Master thesis

Mycobacterium tuberculosis, toxinas, RFLPs y PCR Mycobacterium tuberculosis, toxins BIOLOGÍA Y QUÍMICA CIENCIAS DE LA VIDA MICROBIOLOGÍA OTRAS OTRAS

Estandarización del cultivo de Mycobacterium tuberculosis H37Rv en medio líquido M7H9 y aislamiento de proteínas hidrofóbicas del filtrado de cultivo

LUCÍA GUADALUPE CASTILLON CAMPAóA (2008)

Tesis de maestría en ciencias de la salud

Justificación: En las últimas décadas, una parte de la investigación del proteoma de Mycobacterium tuberculosis H37Rv se ha centrado en las proteínas que éste libera al medio de cultivo en el que crece in vitro (CFP, por las siglas del término en inglés Culture Filtrate Protein). Con este enfoque se espera un avance significativo en el conocimiento de la patogénesis de la tuberculosis y el desarrollo de nuevas vacunas y métodos para el diagnóstico temprano de la enfermedad. Entre las proteínas del CFP, se encuentran proteínas hidrofóbicas relacionadas con la capacidad de invasión, proliferación y supervivencia de la bacteria dentro de las células infectadas, lo que sugiere el potencial valor del aislamiento y purificación este tipo de proteínas. Sin embargo, para estudiar estas proteínas es necesario obtener el CFP en cantidades adecuadas y luego separar a las hidrofóbicas bajo condiciones que preserven su estabilidad. Hipótesis: Mycobacterium tuberculosis H37Rv, cultivado en medio líquido M7H9 enriquecido con caseína hidrolisada, expresa proteínas hidrofóbicas en la cantidad necesaria para separarlas por cromatografía de interacciones hidrofóbicas. Objetivo: Estandarizar el cultivo de Mycobacterium tuberculosis H37Rv, en medio líquido M7H9 enriquecido con caseína hidrolisada, para el aislamiento de las proteínas hidrofóbicas del filtrado de cultivo. Materiales y Métodos: Este fue un trabajo experimental, en el que se utilizaron cultivos axénicos de M. tuberculosis H37Rv desarrollados en el medio de cultivo líquido M7H9 para obtener las proteínas del medio líquido e identificar proteínas afines a adsorbentes hidrofóbicos acilados. Para ello, se probaron dos fuentes distintas de caseína hidrolisada (Bacto-casitona y Triptosa) para enriquecer el medio M7H9, a tres porcentajes (2, 4 y 6%) y tres diferentes tiempos de incubación (4, 6 y 8 semanas). El FP fue cargado a tres adsorbentes hidrofóbicos (Sefarosa acetilada, Sefarosa butilada y Sefarosa hexilada,) y, finalmente, los aislados proteicos obtenidos con Sefarosa acetilada y Sefarosa hexilada, fueron evaluados por microcalorimetría isotérmica para estimar el tipo de interacción hidrofóbica y la constante de afinidad entre el adsorbente y las proteínas. Resultados y Conclusiones: Se establecieron las condiciones de crecimiento de Mycobacterium tuberculosis H37Rv en medio líquido M7H9 enriquecido con Triptosa y Bacto-casitona, con un rendimiento proteico en el filtrado de cultivo de 2.3 a 3.5 mg/L. Al comparar los filtrados de cultivo nativos obtenidos con Bacto-casitona y Triptosa, los perfiles electroforéticos fueron aparentemente similares, sin embargo se encontraron diferencias cualitativas y cuantitativas mediante los ensayos cromatográficos. Con ambos enriquecimientos se demostró que una proporción inesperadamente alta de proteínas del filtrado proteico micobacteriano (aproximadamente 50%) asume un comportamiento hidrofóbico bajo las condiciones cromatográficas ensayadas en este trabajo; la adsorción de las proteínas del filtrado de cultivo y los geles acilados, se basa en una interacción endotérmica entrópicamente dirigida. La fracción de elución obtenida con Sefarosa acetilada y el cultivo de 4 semanas con Triptosa al 2%, parece ser una fuente para la purificación de bandas asociadas por su masa molecular con las proteínas del complejo 85, mientras que las fracciones de elusión obtenidas en Sefarosa butilada y hexilada, a partir del mismo cultivo, podrían servir como fuente para la purificación de bandas relacionadas con proteínas de estrés térmico tales como las de 10, 23, 65 y 70 kDa (estas bandas son más intensas en los cultivos de 6 y 8 semanas) y bandas como la 38 y 45/47 kDa, asociadas con proteínas fuertemente inmunorreactivas. Finalmente, con la estandarización del cultivo de Mycobacterium tuberculosis H37Rv, la demostración de la presencia de proteínas hidrofóbicas en el filtrado de cultivo y su aislamiento con las matrices hidrofóbicas, se sientan las bases para la purificación y caracterización bioquímica e inmunoquímica de estas proteínas micobacterianas.

Master thesis

QR201.T6.C38 Mycobacterium tuberculosis MEDICINA Y CIENCIAS DE LA SALUD CIENCIAS MÉDICAS EPIDEMIOLOGÍA MICROBIOLOGÍA CLÍNICA

Nacobbus aberrans en cultivos hortícolas del Centro del Bajío, México : distribución, abundancia y caracterización molecular

ANSELMO DE JESUS CABRERA HIDALGO (2014)

Tesis (Doctorado en Ciencias, especialista en Fitopatología).- Colegio de Postgraduados, 2014.

Nacobbus aberrans es un fitoparásito con una alta capacidad reproductiva y amplia gama de hospedantes, lo que lo convierte en un patógeno importante y de difícil manejo. Presenta una gran variabilidad morfológica y patogénica, y se distribuye ampliamente en las regiones tropicales y templadas del continente Americano, parasitando a más de 84 especies cultivadas y no cultivadas pertenecientes a 18 familias botánicas. Los objetivos de esta investigación fueron analizar su distribución y abundancia en la región central del Bajío mexicano, y su asociación con las características fisicoquímicas del suelo. Adicionalmente, se evaluó su variabilidad genética y el efecto del fluensulfone sobre su movilidad en condiciones in vitro y en invernadero. El nematodo se encontró en seis municipios de la región central del Bajío asociado a los cultivos de calabacita, pepino, chile, tomate y jitomate induciendo agallamientos del 10 al 100%. Los sitios favorables para su distribución presentaron contenido bajo a medio de materia orgánica, proporción de limo del 20-54% y 18-62% de arena, y pH neutro a medianamente alcalino. Las zonas hortícolas evaluadas presentaron diferentes grados de riesgo para la ocurrencia de N. aberrans. La identificación molecular de las poblaciones recolectadas en la región central del Bajío corroboró que dichas poblaciones corresponden a N. aberrans. Los perfiles polimórficos obtenidos después de digerir el fragmento 18S del DNA ribosomal, muestran ligeras diferencias, principalmente con HaeIII. Las características geográficas, ambientales y de la planta hospedante no diferenciaron genéticamente las poblaciones de N. aberrans, ya que todas fueron congregadas en un mismo grupo al analizar las secuencias del gen 18S. Bajo las condiciones evaluadas, el fluensulfone presentó actividad nematicida irreversible sobre juveniles de N. aberrans. La densidad poblacional final, el número de juveniles y el agallamiento en las plantas de jitomate y pepino se redujeron significativamente al tratarlas con fluensulfone y dicloropropeno + cloropicrina. _______________ NACOBBUS ABERRANS IN HORTICULTURAL CROPS IN CENTRAL BAJIO, MEXICO: DISTRIBUTION, ABUNDANCE AND MOLECULAR CHARACTERIZATION. ABSTRACT: Nacobbus aberrans is a phytopathogen organism with a high reproductive capacity and a wide host range that make it an important and difficult pathogen to manage. The nematode has a great morphological and pathogenic variability, and is widely distributed in the tropical and temperate regions of the American Continent, parasitizing more than 84 cultivated and non-cultivated species belonging to 18 botanical families. The objectives of this research were to analyze their distribution and abundance in the central Bajio region of Mexico, and its association with the physicochemical characteristics of the soil. N. aberrans genetic variability and the fluensulfone effects on its behavior under in vitro and greenhouse conditions were evaluated as well. The nematode was found in six counties of the central Bajio region associated with zucchini, cucumber, pepper, tomato and “tomatillo”, inducing a root galling ranging from 10-100%. The most favorable conditions for N. aberrans occurrence where those with a low to medium organic matter content, a 20-54% of lime, 18-62% of sand, and a neutral to moderately alkaline pH. Horticultural areas showed different degrees of risk for the occurrence of N. aberrans. The molecular identification of the 12 populations collected in the central Bajio region confirmed that this nematode is N. aberrans. Polymorphic patterns obtained after the digestion process of the 18S-DNAr fragment showed slight differences, mainly with HaeIII. Geographical, environmental and host plant characteristics do not genetically differentiated among the N. aberrans populations, since all were clustered in the same group after analyzing the sequences of the 18S gene. Under the tested conditions, fluensulfone presented irreversible nematicidal activity on juveniles of N. aberrans. The final population density, the number of juveniles and root galling in tomato and cucumber were significantly reduced when treated with dichloropropene + chloropicrin and fluensulfone.

Doctoral thesis

N. aberrans Distribución espacial Fluensulfone PCR-RFLPs Caracterización molecular Spatial distribution Molecular characterization Fitopatología Doctorado CIENCIAS AGROPECUARIAS Y BIOTECNOLOGÍA

Recombinant O-mannosylated protein production (PstS-1) from Mycobacterium tuberculosis in Pichia pastoris (Komagataella phaffii) as a tool to study tuberculosis infection.

Carlos Giroshi Bando Campos Daniel Juarez Lopez Sergio Agustin Roman Gonzalez Antonia Isabel Castillo Rodal Clarita Olvera Carranza Yolanda Lopez Vidal Roberto Arreguin Espinosa de los Monteros Clara Ines Espitia Pinzon Mauricio Alberto Trujillo Roldan Norma Adriana Valdez Cruz (2019)

BACKGROUND: Pichia pastoris (syn. Komagataella phaffii) is one of the most highly utilized eukaryotic expression systems for the production of heterologous glycoproteins, being able to perform both N- and O-mannosylation. In this study, we present the expression in P. pastoris of an O-mannosylated recombinant version of the 38 kDa glycolipoprotein PstS-1 from Mycobacterium tuberculosis (Mtb), that is similar in primary structure to the native secreted protein. RESULTS: The recombinant PstS-1 (rPstS-1) was produced without the native lipidation signal. Glycoprotein expression was under the control of the methanol-inducible promoter pAOX1, with secretion being directed by the ?-mating factor secretion signal. Production of rPstS-1 was carried out in baffled shake flasks (BSFs) and controlled bioreactors. A production up to ~ 46 mg/L of the recombinant protein was achieved in both the BSFs and the bioreactors. The recombinant protein was recovered from the supernatant and purified in three steps, achieving a preparation with 98% electrophoretic purity. The primary and secondary structures of the recombinant protein were characterized, as well as its O-mannosylation pattern. Furthermore, a cross-reactivity analysis using serum antibodies from patients with active tuberculosis demonstrated recognition of the recombinant glycoprotein, indirectly indicating the similarity between the recombinant PstS-1 and the native protein from Mtb. CONCLUSIONS: rPstS-1 (98.9% sequence identity, O-mannosylated, and without tags) was produced and secreted by P. pastoris, demonstrating that this yeast is a useful cell factory that could also be used to produce other glycosylated Mtb antigens. The rPstS-1 could be used as a tool for studying the role of this molecule during Mtb infection, and to develop and improve vaccines or kits based on the recombinant protein for serodiagnosis.

Article

Bacteriología Mycobacterium tuberculosis Antígeno Glicoproteína Pichia pastoris PstS-1 Komagataella phaffii MEDICINA Y CIENCIAS DE LA SALUD

Mycobacterium tuberculosis TLR2 agonists LprA, LM and Man-LAM induce notch1 and socs3 transcription

ERIKA NAHOMY MARINO MARMOLEJO CITLALLI TORNEZ BENITEZ VANIA ELVIRA BONIFAZ PENA MABEL GUZMAN RODRIGUEZ HUGO ENRIQUE LOPEZ GONZALEZ ABEL GUTIERREZ ORTEGA MARTHA LETICIA SANTOS MARTINEZ MARIO ALBERTO FLORES VALDEZ (2011)

"Mycobacterium tuberculosis employs a number of strategies to subvert host signaling events, leading to its persistence within macrophages. Upon infection, Mycobacterium bovis BCG induce the expression of suppressor of cytokine signaling 3 (socs3), in a Toll-like receptor 2 (TLR2)-Notch1-dependent manner. Purified phosphatidyl inositol di-mannosides (a TLR2 agonist) act as an inducer for the Notch1-socs3 pathway. This prompted us to analyze other TLR2 agonists seeking for additional molecules that may affect this pathway. We found that lipoprotein LprA, as well as glycolipids lipomannan (LM), and mannose-capped lipoarabinomannan (ManLAM) treatment of murine macrophages resulted in stimulation of notch1 and socs3 transcription."

Article

Mycobacterium tuberculosis Toll-like receptor 2 (TLR2) Notch1 Socs3 Innate immunity BIOLOGÍA Y QUÍMICA

Clustering of Mycobacterium tuberculosis Cases in Acapulco: Spoligotyping and Risk Factors.

Elizabeth Nava Aguilera Yolanda Lopez Vidal Eva Harris Arcadio Morales Perez Steven Mitchell Miguel Flores Moreno Ascencio Villegas Arrizon Jose Legorreta Soberanis Robert Ledogar Neil Andersson (2011)

Recurrence and reinfection of tuberculosis have quite different implications for prevention. We identified 267 spoligotypes of Mycobacterium tuberculosis from consecutive tuberculosis patients in Acapulco, Mexico, to assess the level of clustering and risk factors for clustered strains. Point cluster analysis examined spatial clustering. Risk analysis relied on the Mantel Haenszel procedure to examine bivariate associations, then to develop risk profiles of combinations of risk factors. Supplementary analysis of the spoligotyping data used SpolTools. Spoligotyping identified 85 types, 50 of them previously unreported. The five most common spoligotypes accounted for 55% of tuberculosis cases. One cluster of 70 patients (26% of the series) produced a single spoligotype from the Manila Family (Clade EAI2). The high proportion (78%) of patients infected with cluster strains is compatible with recent transmission of TB in Acapulco. Geomatic analysis showed no spatial clustering; clustering was associated with a risk profile of uneducated cases who lived in single-room dwellings. The Manila emerging strain accounted for one in every four cases, confirming that one strain can predominate in a hyperendemic area.

Article

Bacteriología Mycobacterium tuberculosis Epidemiología MEDICINA Y CIENCIAS DE LA SALUD

Identificación de antígenos inmunodominantes en el filtrado proteico de Mycobacterium tuberculosis H37Rv cultivado en medio líquido Sauton, utilizando el suero de pacientes con tuberculosis del Hospital Infantil del Estado de Sonora

KARLA ALEJANDRA MONGE VILLEGAS (2011)

Tesis de maestría en ciencias de la salud

En los últimos años, la investigación del proteoma de Mycobacterium tuberculosis H37Rv se ha centrado en las proteínas que esta bacteria libera al medio de cultivo en el que crece in vitro. Las proteínas secretadas o CFP (Culture Filtrate Proteins) son antígenos con un alto potencial serodiagnóstico y preventivo, pero para evaluar su inmunodominancia se requieren estudios en distintas poblaciones, ya que los resultados obtenidos en poblaciones adultas sugieren que no hay un antígeno o un grupo de ellos que sea reconocido por todos o la gran mayoría de los pacientes con tuberculosis. En las poblaciones pediátricas es escaso el conocimiento de la inmunodominacia de las CFP. Por esta razón, en este trabajo se realizó la identificación de antígenos inmunodominantes en el filtrado proteico de Mycobacterium tuberculosis H37Rv, utilizando el suero de pacientes pediátricos con tuberculosis. Para lograr esto, se ensayó el suero de 19 pacientes pediátricos con tuberculosis pulmonar, 8 pacientes post-tratamiento, 9 casos de tuberculosis extrapulmonar (6 tuberculosis ósea, 1 caso de tuberculosis intestinal, 1 caso de tuberculosis renal y 1 caso identificado por PCR), 9 contactos y 15 controles. Los resultados obtenidos en el patrón de reconocimiento por el grupo control mostraron un amplio reconocimiento hacia las CFP de 16 a 138 kDa, sin variaciones interindividuales, pero distinto de los reportados previamente en países en los que no se vacuna sistemáticamente a la población pediátrica. El grupo de contactos mostró mayor reactividad hacia una banda de 23 kDa, que no fue reconocida por el grupo control y podría corresponder a la superóxido dismutasa, una proteína inmunodominante entre pacientes con tuberculosis activa, pero que no se había mostrado inmunorreactiva en contactos. El grupo de tuberculosis pulmonar mostró intensa seroreactividad hacia las bandas de 66 y 82 kDa; estos resultados son similares a los reportados previamente. El 33% del grupo de pacientes con tuberculosis extrapulmonar mostró reactividad hacia una banda de 17 kDa, que podría corresponder a la proteína de choque térmico 16.3, reconocida como un factor de virulencia esencial para la supervivencia del bacilo en ambientes hostiles del hospedero e inmunogénica en las formas extrapulmonares de TB. Finalmente, el grupo de post-tratamiento reaccionó con bandas en el rango de 14-20 kDa; no se han publicado reportes utilizando sueros de pacientes post-tratamiento, por lo que la información obtenida en este caso, podría representar una avenida para el avance de la respuesta inmunológica de los pacientes que concluyeron el tratamiento.

Master thesis

QR201.T6 .M65 Antígenos Mycobacterium tuberculosis FORMACIÓN DE ANTICUERPOS