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Autor: ELIZABETH UNDIANO CICERO
Hidrólisis de compuestos tiofosfatos con albúminas del suero de mamíferos
ELIZABETH UNDIANO CICERO (2023)
Los compuestos organofosforados (OP) se consideran de gran preocupación debido a su
neurotoxicidad. Los tratamientos actuales de la intoxicación son ineficaces. Las A-esterasas
son enzimas capaces de hidrolizar OP cuando se activan por cofactores de metales
divalentes. Nuestro grupo de investigación se ha especializado en la búsqueda de A-
esterasas en sueros de diferentes especies. Se encontró que la albúmina sérica de aves
domésticas y marinas mostraba una A-esterasa dependiente de Cu²⁺. Esta actividad se
detectó solo en aves, pero en 2017 nuestro grupo de investigación observó una actividad
dependiente de Cu²⁺ en el suero de cabra sobre el insecticida quiral tricloronato (TCN). La
A-esterasa más conocida en el suero de mamíferos (PON1) es activada por Ca²⁺ y no
hidroliza TCN, lo que sugiere que una o más proteínas en el suero de mamíferos son
capaces de hidrólisis de OP. Identificar y caracterizar estas enzimas es importante para los
campos médico, veterinario y ambiental. En este trabajo realizamos estudios ex vivo de la
hidrólisis de TCN en suero y sus albúminas de humanos y otros mamíferos domésticos
(perro, cabra, cerdo, ovejas y vaca) en presencia de Cu²⁺, Ca²⁺ y EDTA mediante
espectrofotometría UV-Vis y cromatografía quiral. La albúmina sérica de cabra (GSA)
mostró actividad hidrolizante dependiente de Cu²⁺ sobre la mezcla racémica del insecticida
TCN. Una alícuota de 200 μg/mL de GSA mostró una actividad hidrolizante superior al 75%
después de 60 min de reacción con sulfato de cobre a una concentración 100 y 300 μM en
condiciones fisiológicas de pH=7,4 y 37 °C. Esta actividad estuvo entre un 38% y un 58%
mayor con respecto a otras albúminas de mamíferos. La actividad TCNasa de la GSA fue
estereoselectiva, ya que el isómero (+)-TCN presento niveles de hidrólisis significativas
(p˂0.05) de un 45% con respecto a su correspondiente enantiomero (–)-TCN que mostro
niveles de un 33 %. Mientras, las actividades dependientes de Ca²⁺ (2.5 mM) y resistentes
a EDTA (5 mM) (1-6%) no fueron significativas (p>0.05). Esto sugiere que la GSA es la
proteína responsable de la actividad TCNasa dependiente de Cu²⁺ en el suero de cabra.
Con el propósito de identificar el sitio de unión de Cu²⁺ y TCN a GSA, se realizó un estudio
de cálculos de acoplamiento y dinámica molecular, e residuo de His145 de la GSA podría
estar involucrado en el sitio activo de la actividad A-esterasa de esta proteína.
Organophosphate (OP) compounds are considered a high concern due to their
neurotoxicity. Current treatments of intoxication are inefficient. A-esterases are enzymes
capable of hydrolyzing OP when activated by divalent metal cofactors. Our research group
has specialized in the A-esterases search in sera of different species. The domestic and
seabirds’ serum albumin was found to show a Cu²⁺
-dependent A-esterase. This activity was
detected only in birds but in 2017 our research group observed a Cu²⁺
-dependent activity in
goat serum on the chiral insecticide trichloronate (TCN). The best-known A-esterase in
mammalian serum (PON1) is activated by Ca²⁺ and does not hydrolyze TCN which suggests
that one or more proteins in mammalian serum are capable of OP hydrolysis. Identifying and
characterizing these enzymes is important for medical, veterinary, and environmental fields.
In this work we did ex vivo studies of the TCN hydrolysis in serum and its albumins from
humans and other domestic mammals (dogs, goats, pigs, sheep and bovine) in presence of
Cu²⁺, Ca²⁺ and EDTA using UV-Vis spectrophotometry and chiral chromatography for
measuring the compound hydrolysis. Goat serum albumin (GSA) showed Cu²⁺
-dependent
hydrolyzing activity on the insecticide TCN. 200 μg/mL of GSA reaches a substrate
conversion greater than 75% after 60 min of reaction with 100 and 300 μM copper sulfate
under physiological conditions of pH=7.4 and 37 °C. This activity was 38-58% higher than
those observed in our laboratory for other mammals. At the tested conditions, GSA was
significantly (p < 0.05) stereoselective (+)-TCN ˃ (–)-TCN (45% vs. 33%). Ca²⁺
-dependent
(2.5mM) and EDTA-resistant activities (5mM) (1-6%) were not significant (p>0.05). This
suggests that GSA is the protein responsible for theCu²⁺
-dependent TCNase activity in goat
serum. To study Cu²⁺ and TCN binding to GSA, we performed a molecular docking and
dynamic calculations, His145 could be involved in the active site of the protein.
Tesis de doctorado