Título
Optimización de ensayos ddPCR y desarrollo de módulos multiplex para el análisis de diez eventos de modificación genética en maíz
Autor
Angel de León Márquez Luna
Colaborador
OFELIA YADIRA LUGO MELCHOR (Asesor de tesis)
Nivel de Acceso
Acceso Abierto
Materias
Resumen o descripción
La siembra, comercialización y consumo de maíz transgénico es motivo de debate en México, ya que se considera centro de origen y distribución de grano nativo. La reacción en cadena de la polimerasa digital por gotas (ddPCR por sus siglas en inglés) ha demostrado ser más eficiente que el estándar de oro para el análisis de maíz genéticamente modificado. La hipótesis de este trabajo fue que la optimización de estos ensayos permitirá usarlos como método de rutina para el análisis de OGMs. Por tanto, el objetivo de este trabajo fue optimizar ensayos de ddPCR para el análisis de transgenes en maíz y generar módulos multiplex de detección. Por medio de un análisis bioinformático se evaluó la aplicabilidad de los oligonucleótidos, posteriormente con gradientes se determinó una temperatura de hibridación/elongación óptima, así mismo, se evaluó la concentración de oligonucleótidos, la recuperación de gotas y el efecto “lluvia”. La optimización se verificó por medio de ensayos dúplex, y finalmente se desarrollaron módulos multiplex. La temperatura que permitió una separación clara entre clústeres de gotas positivas y negativas para los 11 ensayos simplex fue 58.5°C, con concentraciones relativamente bajas de oligonucleótidos y sondas. Las gotas recuperadas resultaron adecuadas según el propósito de los análisis y la “lluvia” obtenida resultó irrelevante. En los ensayos dúplex se confirmó el potencial para la cuantificación sin usar curvas de calibración, ya que la mayoría de los ensayos estuvieron en concordancia con los reportes de validación o con los porcentajes teóricos de variabilidad genética. Por último, en los módulos multiplex se realizaron variaciones en la concentración de oligonucleótidos y sondas para diferenciar clústeres de gotas positivas en un solo canal detector. Las mejores diferencias se lograron con concentraciones con diferencias de 1:3. Los resultados mostraron que los ensayos optimizados son adecuados para la detección y posible cuantificación de 10 transgenes en maíz.
Fecha de publicación
17 de agosto de 2021
Tipo de publicación
Tesis de maestría
Recurso de información
Formato
application/pdf
Repositorio Orígen
Repositorio Institucional de CIATEJ
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