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Evaluation of the expression and function of the P2X7 receptor and ART1 in human regulatory T-cell subsets

JUAN DIEGO CORTES GARCIA CINTYA DEL REFUGIO LOPEZ LOPEZ NANCY CORTEZ ESPINOSA MARIANA HAYDEE GARCIA HERNANDEZ JUAN MANUEL GUZMAN FLORES ESTHER LAYSECA ESPINOSA LILIANA PORTALES CERVANTES DIANA PATRICIA PORTALES PEREZ (2016)

"Regulatory T cells that express CD39 (CD39+ Treg) exhibit specific immunomodulatory properties. Ectonucleotidase CD39 hydrolyses ATP and ADP. ATP is a ligand of the P2X7 receptor and induces the shedding of CD62L and apoptosis. However, the role of ATP in CD39+ Treg cells has not been defined. Furthermore, NAD can activate the P2X7 receptor via ADP-ribosyltransferase (ART) enzymes and cause cell depletion in murine models. We evaluated the expression and function of P2X7 and ART1 in CD39+ Treg and CD39- Treg cells in the presence or absence of ATP and NAD. We isolated peripheral blood mononuclear cells from healthy subjects and purified CD4+ T cells, CD4+ CD25+ T cells and CD4+ CD25+ CD39+ T cells. P2X7 and ART1 expression was assessed by flow cytometry and real-time PCR. Our results showed low P2X7 expression on CD39+ Treg cells and higher levels of ART1 expression in CD4+ CD39+ T cells than the other subtypes studied. Neither shedding of CD62L nor cell death of CD39+ Treg or CD39- Treg cells was observed by 1mM ATP or 60 mu M NAD. In contrast, P2Xs receptor-dependent proliferation with 300 p,M ATP, was inhibited by NAD in the different cell types analysed. The NAD proliferation-inhibition was increased with P2X5 and A2a agonist and was reversed with P2X5 and A2a antagonist, therefore NAD inhibits P2Xs-dependent proliferation and A2a activation. In conclusion, our results suggest that the altered function and expression of P2X7 and ART1 in the human CD39+ Treg or CD39 Treg cells could participate in the resistance against cell death induced by ATP or NAD. (C) 2015 Elsevier GmbH. All rights reserved."

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P2X7 receptor ART1 ATP NAD Immune regulation CD39 BIOLOGÍA Y QUÍMICA CIENCIAS DE LA VIDA BIOLOGÍA MOLECULAR BIOLOGÍA MOLECULAR

Concentraciones fisiológicas de zinc tienen un efecto dual sobre los receptores P2X de las neuronas mientéricas del cobayo

Liliana Hortencia Méndez Barredo (2019)

"En este trabajo caracterizamos los efectos farmacológicos de las concentraciones fisiológicas de zinc sobre los receptores mientéricos nativos del intestino delgado del cobayo y las isoformas P2X2 presentes en la mayoría de las neuronas mientéricas. Este es el primer estudio que describe efectos opuestos —inhibitorio y potenciador del zinc en estos receptores P2X. No fue posible determinar si ambos efectos dependen de la concentración, aunque el efecto inhibitorio parece ser mediado por antagonismo competitivo y depende de la concentración. El efecto potenciador parece ser mediado por los cambios alostéricos inducidos por el zinc en los canales mientéricos P2X y se observa con mayor frecuencia en las neuronas mientéricas con bajas concentraciones de zinc. El efecto inhibitorio es más común en las variantes P2X2-1 y P2X2-2 que en los canales mientéricos. Sin embargo, en las variantes el efecto potenciador es de igual magnitud que el efecto inhibitorio. Es probable que el efecto inhibitorio y potenciador sean mediados por diferentes sitios de unión que parecen estar presentes en ambas variantes de P2X. En conclusión, en los receptores P2X nativos mientéricos el zinc tiene efectos farmacológicos cuantitativamente diferentes en comparación con los observados en los canales en los canales homoméricos P2X2-1 Y P2X2-2. Los efectos potenciadores e inhibitorios del zinc sobre estos receptores son mediados por dos sitios de unión diferentes. Todos nuestros datos sugieren que los receptores P2X mientéricos tiene una farmacología más compleja que los de los receptores P2X2 recombinantes, lo que probablemente esté relacionado con otras subunidades que se expresan en las neuronas mientéricas. Debido a que estos efectos duales ocurren a concentraciones fisiológicas de zinc, sugerimos que podrían participar en procesos fisiológicos y patológicos."

"We hereby characterized the pharmacological effects of physiological concentrations of zinc on native myenteric P2X receptors from guinea-pig small intestine and on P2X2 isoforms present in most myenteric neurons. This is the first study describing opposite —inhibitory and potentiating— effects of zinc on these P2X receptors. It was not possible to determine whether both effects were concentration dependent, yet the inhibitory effect was mediated by competitive antagonism and was concentration dependent. The potentiating effect appears to be mediated by allosteric changes induced by zinc on P2X myenteric channels, which is more frequently observed in myenteric neurons with low zinc concentrations. In P2X2-1 and P2X2-2 variants, the inhibitory effect is more common than in P2X myenteric channels. However, in the variants, the potentiatory effect is of equal magnitude as the inhibitory effect. Inhibitory and potentiatory effects are likely mediated by different binding sites that appear to be present on both P2X2 variants. In conclusion, in myenteric native P2X receptors, zinc has quantitatively different pharmacological effects compared to those observed on homomeric P2X2-1 and P2X2-2 channels. Potentiatory and inhibitory zinc effects upon these receptors are mediated by two different binding sites. All our data suggest that myenteric P2X receptors have a more complex pharmacology than those of the recombinant P2X2 receptors, which is likely related to other subunits known to be expressed in myenteric neurons. Because these dual effects occur at zinc physiological concentrations, we suggest that they could be involved in physiological and pathological processes."

Doctoral thesis

Neuronas mientéricas Tracto gastrointestinal ATP Zinc Receptores P2X recombinantes Receptores P2X nativos BIOLOGÍA Y QUÍMICA CIENCIAS DE LA VIDA BIOLOGÍA MOLECULAR BIOLOGÍA MOLECULAR

Physiological concentrations of zinc have dual effects on P2X myenteric receptors of guinea pig

Liliana Hortencia Méndez Barredo JESSICA GABRIELA RODRIGUEZ MELENDEZ KAREN SARAHI GOMEZ CORONADO Raquel Guerrero Alba Eduardo Emmanuel Valdez Morales ROSA ESPINOSA LUNA ALMA ROSA BARAJAS ESPINOSA Carlos Barajas López (2018)

"We, hereby, characterize the pharmacological effects of physiological concentrations of Zinc on native myenteric P2X receptors from guinea-pig small intestine and on P2X2 isoforms present in most myenteric neurons. This is the first study describing opposite effects of Zinc on these P2X receptors. It was not possible to determine whether both effects were concentration dependent, yet the inhibitory effect was mediated by competitive antagonism and was concentration dependent. The potentiating effect appears to be mediated by allosteric changes induced by Zinc on P2X myenteric channels, which is more frequently observed in myenteric neurons with low zinc concentrations. In P2X2-1 and P2X2-2 variants, the inhibitory effect is more common than in P2X myenteric channels. However, in the variants, the potentiatory effect is of equal magnitude as the inhibitory effect. Inhibitory and potentiatory effects are likely mediated by different binding sites that appear to be present on both P2X2 variants. In conclusion, in myenteric native P2X receptors, Zinc has quantitatively different pharmacological effects compared to those observed on homomeric channels: P2X2-1 and P2X2-2. Potentiatory and inhibitory Zinc effects upon these receptors are mediated by two different binding sites. All our data suggest that myenteric P2X receptors have a more complex pharmacology than those of the recombinant P2X2 receptors, which is likely related to other subunits known to be expressed in myenteric neurons. Because these dual effects occur at Zinc physiological concentrations, we suggest that they could be involved in physiological and pathological processes."

Article

Myenteric neurons Gastrointestinal tract ATP Zinc P2X2 recombinant receptors P2X native receptors BIOLOGÍA Y QUÍMICA CIENCIAS DE LA VIDA BIOLOGÍA MOLECULAR BIOLOGÍA MOLECULAR

Signaling modulation in cells that control gastrointestinal motility

RAUL LOERA VALENCIA (2014)

"La vida es sustentada en parte por la actividad motora del tracto gastrointestinal. Los patrones de motilidad en dicho tracto son orquestados por la interacción de mecanismos reguladores neurogénicos y miogénicos. Las neuronas mientéricas modulan el reflejo peristáltico a través de circuitos neurales, mientras que las células intersticiales de Cajal (ICC) controlan la generación de oscilaciones rítmicas de voltaje en el músculo liso conocidas como ondas lentas. Las neuronas mientéricas y las ICC modulan su actividad por la señalización de neurotransmisores y su acción sobre la apertura/cierre de canales iónicos. En este trabajo usamos técnicas moleculares para tratar problemas particulares en la señalización de neuronas mientéricas y las ICC. Las neuronas mientéricas usan el ATP como neurotransmisor excitatorio a través de receptores P2X, sin embargo la presencia de P2X3 no parece intervenir en la fisiología normal de la motilidad en el intestino delgado de cobayos. Proponemos que su función se da durante el desarrollo postnatal. Nuestros resultados muestran una reducción en el número de neuronas mientéricas positivas a P2X 3 durante el desarrollo postnatal y el incremento de neuronas P2X 5 positivas en los adultos. La aparición de neuronas P2X2 y P2X4 positivas permaneció estable. La sensibilidad al ATP de neuronas neonatales y adultas no cambió. Las ICC de ratón pueden participar en la modulación de la motilidad colónica a través de señalización muscarínica colinérgica. Nuestros resultados indican que dicha señ alización bloqueó la actividad de canales K+ en cultivos primarios de ICC. La aplicación de un bloqueador de Kv7 también bloqueó la actividad de estos canales y activó un maxicanal en las ICC. RT-PCR de célula única y doble inmunotinción de cólones de ratón revelaron ICC-IM Kv7.5 positivas inervadas por fibras colinérgicas. Sugerimos ampliar el uso de las técnicas moleculares para tratar problemas básicos en la motilidad gastrointestinal."

"Life is sustained in part by the motor activity of the gastrointestinal tract. The motility patterns in the gastrointestinal tract are orchestrated by the interplay of neurogenic and myogenic governing mechanisms. The myenteric neurons modulate the peristaltic reflex through circuits of sensory, motor and interneurons, while interstitial cells of Cajal (ICC) pace the generation of rhythmic voltage oscillations in the smooth muscle known as slow waves. Both system s act together to generate diverse motility patterns in the gut. Myenteric neurons and interstitial cells of Cajal modulate their activity through signaling of neurotransmitters and its effect on the gating of ionic channels. In this work we use diverse molecular techniques to address particular problems in the signalling of myenteric neurons and interstitial cells of Cajal. M yenteric neurons use ATP as excitatory neurotransmitter through P2X receptor signalling, however the presence of P2X 3 does not play a role in the normal physiology of guinea pig small intestinal motility. We propose this subunit has a function in postnatal development. Our results show reduction of P2X3 positive myenteric neurons during postna tal development and increase of P2X5 positive neurons to adulthood, whilst appearance of P2X 2 and P2X4 remained unchanged. This regulation does not alter ATP sensibility in cultured neurons from neonatal or adult guinea pigs. Murine colonic ICC could participate in the modulation of colon motility through muscarinic cholinergic signalling; we provide experimental evidence showing that muscarinic stimulation of ICC blocked K + channel activity in primary cultures. The application of a Kv7 blocker also abolished this activity and activated a maxi channel in ICC. Single cell RT-PCR and double immunostaining of colons revealed Kv7.5 positive ICC-IM and its dense cholinergic innervation. We suggest expanding the use of molecular techniques to approach basic physiological problems in gut motility."

Doctoral thesis

P2X3 ATP Myenteric neurons Kv7 channels ICC Colonic motitlity BIOLOGÍA Y QUÍMICA CIENCIAS DE LA VIDA BIOLOGÍA MOLECULAR

“Functional Interactions Between Nicotinic and P2X Receptors in Guineapig Celiac Ganglia Neurons”

Interacciones Funcionales Entre los Receptores Nicotínicos y P2X en Neuronas del Ganglio Celiaco de Cobayo

FERNANDO OCHOA CORTES (2006)

"En el ganglio celiaco, la liberación de la acetilcolina (ACh) y del ATP activan canales nicotínicos y P2X, respectivamente, y son responsables de la generación de potenciales postsinápticos excitatorios rápidos. Recientemente, se ha reportado que los canales nicotínicos y los P2X mantienen interacciones inhibitorias alostéricas en neuronas de los plexos entéricos. Debido a su importancia funcional, en el presente estudio se investigó la existencia de una interacción similar en las neuronas del ganglio celiaco, utilizando la técnica de Patch Clamp en su configuración de célula completa. Las corrientes inducidas por ACh (IACh) o ATP (IATP) fueron inhibidas por hexametonio o PPADS, respectivamente, indicando que son mediadas por diferentes receptores. Las corrientes inducidas por ACh+ATP (IACh+ATP), solo fueron tan grandes como la corriente inducida por el trasmisor mas efectivo, revelando una oclusión de corriente. La aplicación secuencial de neurotransmisor y las propiedades farmacológicas de IACh+ATP indican que esta corriente es acarreada por ambos canales, los nicotínicos y los P2X. ATP no afecta IACh en neuronas: i) en presencia de PPADS, ii) después de la desensibilización de los receptores P2X o iii) durante las corrientes salientes registradas a potenciales positivos. De igual manera ACh no afecta IATP en neuronas: i) en presencia de hexametonio, ii) después de la desensibilización de los receptores nicotínicos o iii) durante las corrientes salientes registradas a potenciales positivos. La oclusión de corriente se observa tan pronto como se activan los canales, en experimentos realizados a 10ºC, y cuando se agregó estaurosporina (un inhibidor de las proteína-cinasas) al interior de la pipeta, indicando que la oclusión es independiente del metabolismo neuronal. En conclusión, estos resultados son consistentes con un modelo de inhibición cruzada entre receptores nicotínicos y purinérgicos a través de cambios alostéricos. Por el momento, desconocemos la función de tales interacciones, sin embargo, es muy probable que tengan un papel importante en la integración sináptica rápida en el ganglio celiaco."

"Functional interactions between nicotinic (activated by acetylcholine) and P2X (activated by ATP) receptors of celiac neurons from the guinea pig were characterized using whole-cell recordings. Currents induced by ACh (IACh) and ATP (IATP), were inhibited by hexamethonium and PPADS, respectively. Currents induced by ACh+ATP (IACh+ATP), were only as large as the current induced by the most effective transmitter, revealing current occlusion. This occlusion requires maximal activation of both receptors. Sequential applications of neurotransmitters and pharmacological properties of IACh+ATP indicate that this current is carried through both nicotinic (nACh) and P2X channels. ATP did not affect IACh in neurons: i) in the presence of PPADS, a P2X receptor blocker, ii) after P2X receptor desensitization, or iii) during outward currents registered at positive potentials. Similarly, ACh did not affect IATP in neurons: i) in the presence of hexamethonium, a nicotinic receptor blocker, ii) after nicotinic receptor desensitisation, or iii) during outward currents registered at positive potentials. Current occlusion occurred as fast as current activation, and remained present at 10ºC, after adding staurosporine (a protein kinase inhibitor) to the pipette solution. However, current occlusion was not observed at lower concentrations (30 μm). In conclusion, these results are consistent with a model of crossinhibition between nACh and P2X receptors."

Master thesis

Electrofisiologia Patch-Clamp Neuronas simpaticas Neuronas celiacas Canales activados por ligando Receptores ionotropicos Acetlcolina Receptores nACh ATP Receptores P2X Canales iónicos BIOLOGÍA Y QUÍMICA CIENCIAS DE LA VIDA BIOLOGÍA MOLECULAR

El receptor P2X7 contribuye a las corrientes nativas de las neuronas mientéricas de cobayo

EDUARDO EMMANUEL VALDEZ MORALES (2011)

"La configuración de célula completa, varias herramientas farmacológicas y PCR en célula única fueron usadas para investigar la contribución de las subunidad P2X7 en las corrientes inducidas por ATP (IATP) en neuronas mientéricas de cobayo. Las IATP fueron registradas. La curva concentración respuesta para el ATP (0-01-5 mM) mostró dos corrientes, una de alta sensibilidad IATP (IATP(H-S)) observada entre 0-01-0.3 mM y otra de menor sensibilidad IATP (IATP(L-S)) por arriba de 0.3 mM. Los valores calculados de EC50 para estas corrientes fueron 38 y 1759 μM respectivamente. La curva concentración respuesta para el 2’-3’-O-(4- benzoylbenzoyl)-ATP (BzATP) fue monofásica (0-01-1mM) y este agonista fue menos potente (EC50 142 μM) que el ATP para inducir IATP(H-S) pero más potente que el ATP para activar IATP(L-S). Una fuerte rectificación fue observada cuando IATP(L-S) fue activada y para IBzATP (0.1 mM) pero una rectificación mínima fue observada cuando la IATP(L-S) fue activada (5 mM). Brilliant blue G (BBG; 0.3 μM, concentración que inhibe solo a los receptores P2X7) inhibe significantemente las IATP(L-S) pero no afecta a las IATP(H-S) y las IBzATP. Utilizando la técnica de RT-PCR en célula única, el ARNm de P2X7 fue detectado en 7 células de 13 que amplificaban también el ARNm de P2X2. En conjunto nuestros datos muestran que P2X7 es el probable responsable de las IATP(L-S) mientras que en la gran mayoría de las neuronas las IATP(H-S) pueden estar mediadas por, al menos en parte, por las subunidades P2X2."

"The whole-cell configuration, various pharmacological tools, and single cell PCR were used to investigate the contribution of P2X7 subunits to the ATP-induced currents (IATP) of guinea pig myenteric neurons. IATP was recorded in tested neurons. ATP concentration-response curve (0.01-5 mM) showed two currents, one high sensitive IATP (IATP(H-S)) observed between 0.01-0.3 mM and another low sensitive IATP (IATP(L-S)) above 0.3 mM. The calculated EC50 values to induce these currents were 38 and 1759 μM, respectively. 2’-3’-O-(4-benzoylbenzoyl)-ATP (BzATP) concentration-response curve was monophasic (0.01-1 mM) and this agonist was less potent (EC50 142 μM) than ATP to induced IATP(H-S) but more potent than ATP to activate IATP(L-S). A strong inward rectification was noticed for IATP(H-S) and for IBzATP (0.1 mM) but a minimal rectification was noticed when IATP(L-S) was activated (5 mM). Brillian blue G (BBG; 0.3 μM, concentration known to inhibit only P2X7 receptors), significantly inhibited IATP(L-S) but neither affect IATP(H-S) nor IBzATP. Using the single-cell RT-PCR technique P2X7 mRNA was detectable in 7 out of 13 (out of 14) myenteric neurons exhibiting P2X2 mRNA. Altogether, our results show that P2X7 is likely responsible for the IATP(L-S), whereas, in the great majority of neurons IATP(H-S) are likely mediated by channels constituted, at least in part, by P2X2 subunits."

Doctoral thesis

ATP Neuronas mientéricas Receptor P2X7 BIOLOGÍA Y QUÍMICA CIENCIAS DE LA VIDA BIOLOGÍA MOLECULAR

Purinergic modulation of hippocampal synaptic activity

JESSICA GABRIELA RODRIGUEZ MELENDEZ (2017)

"El ATP actúa como un neurotransmisor rápido y neuromodulador en el hipocampo, un área cerebral implicada en el aprendizaje y la memoria. Sin embargo, los receptores purinérgicos y la transducción de señales implicados en esta neuromodulación no son bien conocidos. En el presente trabajo, se estudiaron los efectos moduladores de la ATP sobre la actividad sináptica hipocampal espontanea e inducida. Se obtuvieron registros de Patch-clamp en su modalidad de célula completa de neuronas hipocampales CA1 en rebanadas de hipocampo de ratones C57BL / 6J (8 semanas de edad, macho o hembra). El ATP inhibió la amplitud y la frecuencia de las corrientes postsinápticas excitatorias espontáneas (EPSCs).Tal efecto no fue reversible. El ATP también inhibió la amplitud de EPSC evocadas, pero tal efecto parece ser reversible. En conclusión, la ATP inhibe la transmisión sináptica glutamatérgica en las neuronas del hipocampo CA1. Se requieren experimentos adicionales para determinar por qué los efectos sobre las EPSC espontáneas y evocadas parecen lavarse con diferentes cinéticas."

"ATP acts as a fast neurotransmitter and neuromodulator in the hippocampus, a brain area implicated in learning and memory. However, the purinergic receptors and their signal transduction involved in this neuromodulation are not well understood. In the present work, we studied the modulatory effects of ATP on spontaneous and induced hippocampal synaptic activity. Whole-cell patch clamp recordings were obtained of CA1 hippocampal neurons in hippocampal slices of C57BL/6J mice (8 weeks old, male or female). ATP inhibited the amplitude and frequency of spontaneous excitatory postsynaptic currents (EPSCs). Such an effect was not reversible. ATP also inhibited the amplitude of evoked EPSCs but such an effect appears to be reversible. In conclusion, ATP inhibits the glutamatergic synaptic transmission in CA1 hippocampal neurons. Additional experiments are required to determine why the effects on spontaneous and evoked EPSCs appear to wash with different kinetics."

Master thesis

ATP EPSCs CA1 NMDA AMPA P2Y BIOLOGÍA Y QUÍMICA CIENCIAS DE LA VIDA BIOLOGÍA MOLECULAR BIOLOGÍA MOLECULAR

Caracterización electrofisiológica de receptores hP2X1 y hP2X1del coexpresados en ovocitos de Xenopus laevis

KAREN SARAHI GOMEZ CORONADO (2018)

"Los leucocitos humanos liberan nucleótidos, incluyendo ATP, que al unirse a receptores purinérgicos, son capaces de desencadenar diferentes procesos celulares, incluyendo la muerte de patógenos. El estudio de los mecanismos inmunomoduladores de los receptores P2X en procesos inflamatorios podría elucidar el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas. Existen pocos estudios concernientes al receptor P2X1 de humano (hP2X1) y de su variante de splicing (P2X1del), previamente reportada como no funcional. Nuestro laboratorio ha encontrado esta variante de splicing en monocitos humanos, por lo que el objetivo de este trabajo fue caracterizar las propiedades farmacológicas del receptor canónico hP2X1 y su variante de splicing P2X1del. En este estudio, se obtuvieron registros de corrientes inducidas por el ATP, utilizando la técnica de voltage-clamp con dos electrodos en ovocitos de Xenopus laevis inyectados con ARNm del receptor hP2X1y P2X1del. Las concentraciones utilizadas del agonista fueron: 0.1 a 5000 μM de ATP para hP2X1 y 100 a 5000 µM de ATP para P2X1del, también se aplicó suramina a concentraciones de 0.1 a 100 µM para hP2X1. Nuestras observaciones muestran que las corrientes mediadas por el receptor hP2X1 tienen dos fases como respuesta al ATP y que ambas son independientes, ya que una se correlaciona con la apertura de un canal y la otra es más compatible con la apertura de un estado de poro. Nuestras observaciones indican que uno de los dos sitios de unión tiene alta sensibilidad al ATP y media la activación rápida de una corriente cuya amplitud decrece en pocos segundos (desensibilización), a pesar de la presencia continua del agonista. El segundo sitio de unión tiene baja sensibilidad por ATP, y su estimulación desenlaza una segunda fase en la cual la corriente de entrada aumenta lentamente y su magnitud depende del tiempo de exposición al ATP. A diferencia de lo reportado, nuestros resultados sugieren que la suramina ejerce dos efectos. El primero es inhibitorio y es evidente a concentraciones altas de suramina (µM), lo que concuerda con lo descrito en la literatura. También descubrimos un novedoso y segundo efecto de potenciación, quizá a través de la estimulación de un segundo sitio de unión con mayor afinidad a la suramina ya que persiste incluso después de su lavado."

"Human leukocytes release nucleotides, including ATP, bind to purinergic receptors to trigger a number of cellular process, such as the death of pathogens. The understanding of the immunomodulator mechanisms of nucleotides could help to develop new therapeutic strategies for immune disease and inflammation. Currently, there are few studies on the human P2X1 receptor (hP2X1) and its splicing variant (hP2X1del), previously reported as non-functional. Our research group was the first to describe this splicing variant in human monocytes and because little is known about the pharmacological properties of hP2X1 and its splicing variant hP2X1del, the aim here was to characterize these properties. In this study, we measured the currents induced by ATP using the two-electrodes voltaje clamp technique, in oocytes of Xenopus laevis injected with hP2X1y P2X1del mRNA. ATP concentrations ranged from 0.1 to 5000 μM for hP2X1 and 100 to 5000 μM of ATP for hP2X1del, whereas 0.1 to 100 μM suramin concentrations were used for hP2X1. Suramin was not tested for currents mediated via the hP2X1del receptor. Our results demonstrate that currents mediated by the hP2X1 receptors have two phases and that their activation and inactivation kinetics are independent of each other. One of the two binding sites has high sensitivity to ATP and mediates the rapid inward current, which decreased in only few seconds, despite the continuous presence of the agonist. The second binding site has a low sensitivity to ATP, causing a second phase, whose amplitude increases slowly as a function of ATP exposure time. We hereby confirm a suramin elicited effect,that mediates inhibition and is elicited by high concentrations of suramin. However, in contrast to what has been reported, our results suggest that suramin has a second, novel effect at low suramin concentrations, and it likely act via a second binding site with high affinity for suramin producing potentiation rather than inhibition. This effect persists post washing, suggesting that suramin remains attached to the receptor for various minutes."

Master thesis

P2X P2X1del ATP Suramin Voltage- clamp BIOLOGÍA Y QUÍMICA CIENCIAS DE LA VIDA BIOLOGÍA MOLECULAR BIOLOGÍA MOLECULAR

La apertura de los canales activados por ligando no es independiente

MARCELA MIRANDA MORALES (2006)

"La interacciones inhibidoras entre los canales GABAA (activados por GABA) y P2X (activados por ATP) o 5-HT3 (activados por serotonina) en neuronas mientéricas del intestino delgado del cobayo fueron caracterizadas utilizando registros de célula completa. Las corrientes inducidas por GABA (IGABA) fueron inhibidas por picrotoxina o bicuculina, aquellas inducidas por ATP (IATP) fueron inhibidas por PPADS (un antagonista de los receptores P2X) y por una concentración alta de Ca2+, mientras que, aquellas inducidas por serotonina (I5- HT) fueron inhibidas por tropisetron. Las corrientes inducidas por GABA+ATP (IGABA+ATP) o por GABA+5HT (IGABA+5-HT) fueron menores que la suma de las corrientes individuales, revelando una oclusión de las corrientes. Esta oclusión requiere de la activación máxima de al menos uno de los receptores. Las características cinéticas y farmacológicas de IGABA+ATP o IGABA+5-HT indican que estas son mediadas por canales GABAA y P2X o por canales GABAA y 5-HT3, respectivamente. El ATP (o la 5-HT) no afectó IGABA en neuronas en las cuales: i) los canales P2X (o los 5-HT3) no estaban presentes, ii) después de inhibir los canales P2X con Ca2+, iii) en presencia del PPADS (o en presencia del tropisetron), iv) después de desensibilizar los receptores P2X (o los 5-HT3), o v) en el potencial de inversión de la IATP. De manera similar, el GABA no afectó las corrientes mediadas por los canales P2X (o por los 5-HT3) en neuronas en las cuales: i) los canales GABAA no estaban presentes, ii) en presencia de picrotoxina o bicuculina, antagonistas de los receptores GABAA, iii) después de desensibilizar los receptores GABAA, o iv) en el potencial de inversión de la IGABA. La oclusión de la corriente ocurrió tan rápido como la activación de los receptores. Estuvo presente en ausencia del Ca2+, en experimentos a temperatura baja (11ºC), después de agregar a la solución de la pipeta varios inhibidores de las proteín-cinasas (estaurosporina, genisteina o K-252a), después de sustituir GTP por GDP-β-S en la pipeta, y después de tratar las células con Netilmaleimida. Estos resultados son consistentes con un modelo de inhibición cruzada entre los receptores GABAA y P2X, y entre los receptores GABAA y 5- HT3."

"Inhibitory interactions between GABAA (activated by GABA) and P2X (activated by ATP) or 5-HT3 (activated by serotonin) receptors of myenteric neurons from the guinea pig small intestine were characterized using whole-cell recordings. Currents induced by GABA (IGABA) were inhibited by picrotoxin or bicuculline, those induced by ATP (IATP) were inhibited by PPADS (a P2X receptor antagonist) and a high concentration of Ca2+, whereas those induced by serotonin (I5-HT) were inhibited by tropisetron. Currents induced by GABA+ATP (IGABA+ATP) or by GABA+5HT (IGABA+5-HT) were smaller than the addition of the individual currents, revealing current occlusion. This occlusion requires maximal activation of at least one of these receptors. Kinetic and pharmacological properties of IGABA+ATP or IGABA+5-HT indicate that they are carried through both GABAA and P2X channels or GABAA and 5-HT channels, respectively. ATP (or 5-HT) did not affect IGABA in neurons in which: i) P2X (or 5-HT3) channels were not present, ii) after inhibiting P2X channels with Ca2+, iii) in the presence of PPADS (or in the presence of tropisetron), iv) after P2X (or 5-HT3) receptor desensitisation, or v) at IATP reversal potential. Similarly, GABA did not affect P2X (or 5-HT3) mediated currents in neurons in which: i) GABAA channels were not present, ii) in the presence of picrotoxin or bicuculline, GABAA receptor antagonists, iii) after GABAA receptor desensitisation, or iv) at the IGABA reversal potential. Current occlusion occurred as fast as current activation. It was still present in the absence of Ca2+, when experiments were performed at low temperature (11ºC), after adding to the pipette solution a cocktail of protein kinase inhibitors (staurosporine, genistein or K-252a), after substituting the GTP in the pipette with GDP-β-S, and after treating the cells with N-ethylmaleimide. These results are consistent with a model of cross-inhibition between GABAA and P2X and between GABAA and 5-HT3 receptors."

Doctoral thesis

Sistema nervioso entérico Receptores GABAA Cobayos Canales iónicos Receptores Cys loop Canales P2X Receptores 5-HT3 ATP Derotonina GABA Neurotransmisores Interacciones proteínicas Autor Fijación de voltaje Cultivos neuronales Sinapsis BIOLOGÍA Y QUÍMICA CIENCIAS DE LA VIDA BIOLOGÍA MOLECULAR

Los receptores P2X nativos de neuronas mientéricas del intestino de ratón y cobayo poseen propiedades distintas

RAQUEL GUERRERO ALBA (2009)

"Las propiedades farmacológicas y fisiológicas de los receptores P2X en neuronas mientéricas del intestino delgado de ratón y cobayo fueron caracterizadas utilizando la técnica Patch Clamp en su configuración de célula completa. La aplicación rápida de ATP (1-3000 μM) indujo una corriente entrante rápida en el 95% de las neuronas mientéricas registradas en ambas especies cuando se fijo el voltaje a -60 mV. Curvas concentración-respuesta para ATP (1-3000 μM) produjo un valor de EC50 de 114 y 115 μM, con un coeficiente de Hill de 1.02 y 0.79, para las neuronas mientéricas de ratón y de cobayo, respectivamente. El α,β-metilen ATP (α,β-meATP) fue inactivo. Piridoxalfosfato-6-azofenil-2’,4’-acido disulfónico (PPADS) (0.01-30 μM) inhibió las corrientes inducidas por ATP (IATP) con diferente potencia, siendo los valores IC50 de 0.61 y 1.8 μM en neuronas mientéricas de ratón y de cobayo, respectivamente. En neuronas mientéricas de ratón, la respuesta a ATP fue inhibida por suramina, mientras que en neuronas mientéricas de cobayo observamos ambos efectos, potenciación e inhibición, de estas corrientes. En cobayo, ambos efectos de suramina tienen diferente dependencia de la concentración y cinética de recuperación, indicando que son mediados por al menos dos sitios de unión diferentes. Nuestros resultados indican que los receptores P2X mientéricos de ratón tienen diferentes propiedades farmacológicas que los presentes en cobayo."

"Whole-cell patch clamp recordings were used to characterize the physiological and pharmacological properties of P2X receptors (P2XRs) of mouse and guinea-pig myenteric neurons from the small intestine. ATP application induced a rapid inward current in 95% of recorded neurons of both species when were voltage clamped at -60 mV. Concentration-response curves for ATP (1-3000 μM) yielded EC50 values of 114 and 115 μM for mouse and guinea-pig myenteric neurons, respectively, with a Hill coefficient value of 1.02 and 0.79, respectively, which were not significantly different from unity. The α,β-methylene ATP (100 μM) was virtually inactive. Pyridoxalphophate-6-azophenyl-2´,4´-disulphonic acid (PPADS; 0.01-30 μM) inhibited the ATP-induced currents (IATP) with a different potency; being the IC50 0.61 and 1.8 μM in mouse and guinea-pig, respectively. In mouse myenteric neurons, IATP were inhibited by suramin whereas in guinea pig neurons we observed two effects, potentiation and inhibition of these currents. On guinea pig, both effects of suramin had different recovering kinetics and concentration dependency, indicating that they are mediated by at least two different binding sites. Our observations indicate that myenteric P2XRs in these two species have different pharmacological properties."

Doctoral thesis

Suramina ATP Receptores P2X Neuronas mientéricas BIOLOGÍA Y QUÍMICA CIENCIAS DE LA VIDA BIOLOGÍA MOLECULAR