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Fertilización in vitro en cerdos

MIGUEL ANGEL MUÑOZ VALDEZ (2005)

"Descripción / Resumen Editar Eliminar "La fertilización in vitro (FIV), empleada con éxito a partir de 1980 para generar embriones humanos y de otras especies animales, se basa en el cocultivo de gametos femeninos madurados in vitro con espermatozoides capacitados. Tres problemas undamentales de la reproducción asistida del cerdo son la maduración de los ovocitos, la capacitación espermática y la polispermia. Para poder abordarlos en el futuro implementamos un método apropiado para la FIV del cerdo en cuatro etapas: obtención de complejos cúmulo-ovocito (CCO), maduración in vitro (MIV) de CCO, capacitación de espermatozoides0000 y cocultivo de gametos. Obtención de CCO. En cada experimento fueron empleados 10 ovarios de hembras de talla comercial, transportados del rastro al laboratorio en soluciónsalina amortiguada con fosfatos a 4°C con penicilina, estreptomicina y anfotericina. Los CCO fueron aislados a partir de folículos de 0.3-6 mm de diámetro mediante corte con bisturí; la tasa de extracción fue ~1.5 CCO/min y la liberación fue lograda agitando el ovario sumergido en medio de Dulbecco con antibióticos. Los CCO liberados fueron aspirados con micropipeta bajo el estereomicroscopio y clasificados por su aspecto: tipo 1, CCO degradados; tipo 2, sin células del cúmulo; tipos 3 y 4 con células del cúmulo disminuidas en número; tipo 5, con el máximo número de células del cúmulo compactas y uniformes. Para la MIV lostipos 3, 4 y 5, con potencial para madurar, representaron el 88% de los CCO aislados. MIV. Grupos de 30-40 CCO de los tipos 3-5 fueron incubados a 38.5°C durante dos periodos sucesivos de 22 h en atmósfera húmeda con CO2 al 5%; el primer periodo en medio 199 con hormona luteinizante y folículoestimulante y el segundo en el mismo medio sin hormonas. Los cambios microscópicos indicativos de maduración de los CCO aptos para FIV fueron:1) aspecto viable (tipo 3-5), 2) células del cúmulo aumentadas en número y tamaño y 3) aparición de zona pelúcida. El 77% de los CCO maduraron in vitro con predominio del tipo 5 (37%), seguido de los tipos 3 (21%) y 4 (19%). Capacitación. Los espermatozoides porcinos (adquiridos de Pig improvement, lote No. 337) a una concentración de 3×106/ml fueron diluidos en medio de Dulbecco a 15×105/ml e incubados 1.5 h a 37°C en atmósfera húmeda con CO2 al 5% para volverlos hipermótiles (indicador principal de la capacitación)."

"In vitro fertilization (IVF), successfully used since 1980 to generate human and other animal embryos, is based in the in vitro coculture of mature female gametes with capacitated spermatozoa. Three major problems of assisted pig reproduction are oocyte maturation, sperm capacitation and polispermy. In order to approach them in the future we implemented an appropriate pig IVF method in four stages: obtention of cummulus-oocyte complexes (COC’s), in vitro maturation (IVM) of COC’s, sperm capacitation, and gamete coculture. Obtention of COC’s. In each experiment 10 ovaries from commercial-size females were used, transported from the slaughterhouse to the laboratory in phosphate-buffered saline containing penicillin, streptomycin and amphotericin at 4°C. COC’s were isolated by scalpel section of 0.3-6 mm-diameter follicles; the rate of extraction was ~1.5 CCO/min and release was attained by shaking the ovary in Dulbecco’s culture medium. Released COC’s were aspirated with a micropipette under a stereomicroscope and classified by their aspect: type 1, degraded COC’s; type 2, without cummulus cells; types 3 and 4 with cummulus cells decreased in number; type 5, with the maximum number of compact and uniform cummulus cells. For IVM, types 3, 4 and 5, with potential to mature, represented 88% of the isolated COC’s. IVM. Groups of 30-40 type 3-5 CCO’s were incubated at 38.5°C for two successive periods of 22 h in a humid atmosphere with 5% CO2; the first period in medium 199 with luteinizing and follicle-stimulating hormones and the second one in the same medium devoid of hormones. The microscopic changes indicating that matured CCO had become apt for IVF were: 1) viable aspect (type 3-5), 2) cummulus cells increased in number and size and 3) a distinctive pellucid zone. Seventy-seven percent of COC’s matured in vitro with predominance of the type 5 (37%), followed by types 3 (21%) and 4 (19%). Capacitation. Pig spermatozoa (purchased from Pig improvement, lot No. 337) at a concentration of 3×106/ml were diluted in Dulbecco’s medium at 15×105/ml and incubated for 1.5 h to 37°C in humid atmosphere with 5% CO2 to make them hypermotile (major indicator of capacitation)."

Master thesis

Cerdo Fertilización in vitro Maduracción de ovacitos Capacitación espermática Cocultivo de gametos BIOLOGÍA Y QUÍMICA CIENCIAS DE LA VIDA BIOLOGÍA MOLECULAR

Efecto del peróxido de hidrógeno y el neuropéptido APGWamida como inductores a la liberación de gametos en abulón azul (Haliotis fulgens)

Effect of hydrogen peroxide and neuropeptide APGWamide as inducers to spawning in green abalone (Haliotis fulgens)

ARACELI GARCIA AGUILAR (2019)

El abulón azul (Haliotis fulgens) es una especie de importancia comercial en la región central de la península de Baja California, México. El presente trabajo tuvo como objetivo evaluar el efecto de los inductores: H2O2-TRIS y APGWamida a dos concentraciones 1) H2O2-TRIS a 6 y 9 % V/V y 2) el tetrapéptido APGWamida suministrado vía intramuscular a 2.5 y 5 µg de APGWamida por gramo de organismo. Los experimentos se realizaron con organismos en tres etapas reproductivas, con gónadas al inicio de su maduración en índice visual gonadal (IVG) de 1, totalmente maduras (IVG 3) y en reabsorción. En el presente trabajo, se muestra que las hembras de abulón azul en IVG 1 de cultivo a H2O2-TRIS 9 % respondieron el 83 % de las hembras inducidas liberaron gametos después de 7-8 h (4,700 ± 940 ovocitos totales por hembra). Por otra parte, con APGWamida a 5 µg/g respondió el 66 % de las hembras entre las 4-6 h con (7,666 ± 945 ovocitos por hembra). En el caso de los machos de cultivo con IVG 1, tanto con el inductor H2O2-TRIS al 9 % y APGWamida a 2.5 µg/g respondieron el 50 %, entre las 5-7 h y las 4-6 h, respectivamente. En este experimento no se midió cantidad de espermatozoides en machos, pero se observó buena motilidad (80%) y se realizó una fertilización, pero no hubo fecundación debido a la inmadurez de los ovocitos usados. Los organismos silvestres en IVG 3, el 50 % de las hembras inducidas respondieron con H2O2-TRIS 6 %, en un intervalo de 5 y 8 h post-inducción (168 000 por hembra). Mientras que en la condición con APGWamida a 2.5 µg/g respondieron el 100 % de las hembras entre las 5-6 h, con una cantidad de (610,000 ± 3000 ovocitos por hembra). Por otra parte, el 100 % de los machos silvestres con IVG 3 respondieron a los tratamientos con APGWamida (control con solo solución de Ringer´s, 2.5 y 5 µg de APGWamida por gramo), entre las 5 y 9 h promedio post-inyección, (5 y 6 X 105 espermas por macho). En este experimento los organismos del control respondieron, sin embargo pudo ser debido a la condición de estrés y del grado de madurez. Ambos métodos indujeron la liberación de gametos y presentan ventajas dependiendo del interés del objetivo de reproducción, por lo que es necesario probar otras concentraciones, así como establecer un protocolo de fertilización adecuado, ya que no existe para la especie.

Green abalone (Haliotis fulgens) is an important commercial species in the central region of the peninsula of Baja California, Mexico with aquaculture potential. The objective of this work was to evaluate the effect of spawning inductors: H2O2-TRIS at 6 % and 9 % V/V and APGWamide injected at 2.5 and 5 µg of APGWamide per gram of body. The experiments were performed with organisms in three different reproductive stages according to their Visual Gonad Index (IVG): non-mature gonads (IVG 1) fully mature (IVG 3) and spawned. Results indicated that for cultured organisms in IVG 1, 83% females spawned between 7-8 h post-induction when 9% H2O2-TRIS was used (4,700 ± 940 total oocytes per female). On the other hand, 66 % females injected with 5 µg/g spawned between 4-6 h post-induction (7,666 ± 945 oocytes per female). For males, 50 % of them spawned when induced with 9 % H2O2-TRIS or 2.5 µg/g APGWamida between 5-7 h and 4-6 h post-induction, respectively. Motility of sperm was 80 %. Sperm was used to fertilize eggs but fertilization failed due to immature eggs. For wild organisms in IVG 3, 50 % females spawned 5 and 8 h post-induction when 6 % H2O2-TRIS was used (168,000 per female) while 100 % females spawned between 5-6 h post-induction when 2.5 µg/g APGWamida was injected (610,000 total oocytes per female). Also, 100% males spawned between 5-9 h post-induction when 2.5 and 5 µg of APGWamida per gram APGWamida was used. Sperm concentration was around 5-6 X 105 per male. In this experiment, organisms from the control treatment spawned due to stress and ripeness. No fertilization was obtained in this experiment. Both methods induced spawning and have different advantages depending of the objectives in a reproduction programs. New concentrations and inductors should be tested. Also, new approaches to fertilize eggs should be developed since optimal protocols are lacking.

Master thesis

Haliotis fulgens, Abulón azul, Reproducción, Inducción a la liberación de gametos Haliotis fulgens, Green abalone, Reproduction, Spawning BIOLOGÍA Y QUÍMICA CIENCIAS DE LA VIDA BIOLOGÍA ANIMAL (ZOOLOGÍA) INVERTEBRADOS INVERTEBRADOS